Lipopolysaccharide-pretreated mesenchymal stem cell-conditioned medium optimized with 10 kDa filter attenuates the injury of H9c2 cardiomyocytes in a model of hypoxia/reoxygenation

Abstract

Mesenchymal stem cell-derived conditioned medium (MSC-CM) improves cardiac function, which is partly attributed to the released paracrine factors. Since such cardioprotection is moderate and transient, it is essential that MSC-CM's effective components are optimized to alleviate myocardial injury. To optimize MSC-CM, MSCs were treated with or without lipopolysaccharides (LPSs) for 48 h (serum-free), and the supernatant was collected. Then, LPS-CM (MSC stimulated by LPS) was further treated with LPS remover (LPS Re-CM) or was concentrated with a 10 kDa cutoff filter (10 kDa-CM). Enzyme-linked immunosorbent assay showed that all the pretreatments increased the levels of vascular endothelial growth factor (VEGF), hepatocyte growth factor (HGF), and insulin growth factor (IGF) except LPS Re-CM; 10 kDa-CM was superior to the other CMs. Cell Counting Kit-8 displayed that the viability of injured H9c2 cells was enhanced with the increase in the MSC-CM concentration. We also found that the 10 kDa-CM significantly alleviated H9c2 hypoxia/reoxygenation (H/R) injury, as evidenced by the increased Bcl-2/Bax ratio, and decreased the levels of lactate dehydrogenase and cardiac troponin. Transmission electron microscopy (TEM), TdT-mediated dUTP nick-end labelling (TUNEL), and hematoxylin and eosin staining (H&E) confirmed that 10 kDa-CM inhibited H/R-induced H9c2 morphological changes. Proteomic analysis identified 41 differentially expressed proteins in 10 kDa-CM, among which anti-inflammation, proangiogenesis, and antiapoptosis were related to cardiac protection. This study indicates that 10 kDa-CM protects H9c2 cardiomyocytes from H/R injury by preserving most of the protective factors, such as VEGF, HGF, and IGF, in MSC-CM.

Graphical AbstractRésumé

Le milieu conditionné à partir de cellules souches mésenchymateuses (MC-SSM) permet d’améliorer la fonction cardiaque, ce qui est partiellement attribuable à la libération de facteurs paracrines. Comme une telle cardioprotection est modérée et transitoire, il est essentiel d’optimiser les composantes efficaces du MC-SSM pour permettre d’atténuer les lésions cardiaques. Afin d’optimiser les MC-SSM, nous avons mis les SSM en présence ou non de lipopolysaccharides (LPS) pendant 48 heures (sans sérum), puis recueilli le surnageant. Ensuite, nous avons plus avant exposé le MC-LPS (SSM stimulées à l’aide de LPS) à un dissolvant des LPS (MC-Diss LPS) ou encore nous l’avons concentré à l’aide d’un filtre de 10 kDa (MC-10 kDa). La méthode d’ELISA a montré que toutes les expositions préalables ont entraîné une augmentation des taux de VEGF, d’HGF et d’IGF à l’exception du dissolvant des LPS; le MC 10 kDa était supérieur aux autres MC. Le CCK-8 a montré que la vitalité des cellules H9c2 lésées s’accentuait avec l’augmentation de la concentration du MC-SSM. Nous avons aussi observé que le MC-10 kDa permettait d’atténuer les lésions des cellules H9c2 par l’hypoxie/réoxygénation (H/R) de façon marquée : nous avons mis en évidence une augmentation du ratio Bcl-2/Bax, de même que la diminution des taux de LDH et de troponine cardiaque (cTn). Les techniques de microscopie électronique par transmission et de TUNEL ainsi que la coloration à l’H-E ont permis de confirmer que le MC-10 kDa entraînait une inhibition des variations morphologiques entraînées par l’H/R dans les cellules H9c2. Les études de protéomique ont permis d’identifier 41 protéines exprimées de manière différentielle dans le MC-10 kDa, avec lesquelles des phénomènes anti-inflammatoires, angiogéniques et anti-apoptotiques étaient liés à une protection cardiaque. Cette étude montre que le MC-10 kDa permet de protéger les cardiomyocytes de type H9c2 contre des lésions d’H/R par l’intermédiaire de facteurs de protection comme le VEGF, l’HGF et l’IGF dans le MC-SSM.

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